Obtención y caracterización de bioconjugados de metotrexato para la producción de anticuerpos

Abstract

Los métodos analíticos para la identificación y cuantificación de metotrexato (MTX) se han diversificado y mejorado notablemente. Entre todos ellos, los métodos inmunoenzimáticos se han posicionado de manera sobresaliente debido a que son procedimientos que presentan prestaciones analíticas importantes en términos de sensibilidad, especificidad y potencial para tratar un gran número de muestras, a un costo relativamente inferior que aquéllas de índole instrumental. En este trabajo, se abordó la obtención de bioconjugados proteicos del MTX (BSA, OVA y HRP) y su caracterización, para ser utilizados como inmunorreactivos para la eventual producción de anticuerpos e identificación de MTX en ensayos inmunoenzimáticos en plataforma sólida tipo ELISA. Al objeto de realizar la conjugación proteica, se aprovecharon los carboxilatos disponibles en la estructura del MTX y los grupos -NH2 libres de los restos de lisina en las proteínas correspondientes. Etapa que implicó la formación del éster activo de MTX utilizando 1.3 equivalentes de carbonato de N,N’-disuccimidilo y 3.8 equivalentes de trietilamina en DMF anhidra. La obtención de los conjugados inmunizantes de mtx-C-BSA, de ensayo mtx-C-OVA y de señalización mtx-C-HRP, se prepararon a partir de disoluciones acuosas de la proteína correspondiente, en buffer de carbonatos 50 mM pH 9.6 y la adición del éster activo del hapteno del MTX. La determinación de la carga hapténica se realizó por UV/Vis y espectrometría de masas MALDI-TOF para cada uno de los bioconjugados resultando: 5.5 haptenos/ BSA que se utilizó como bioconjugado de inmunización, 3.0 haptenos/OVA para emplearse como conjugado de tapizado, y finalmente una relación de un hapteno por HRP, mismo que se empleó como trazador enzimático. Se aplicó un protocolo de inmunización en conejo hembra New Zealand blanco utilizando el bioconjugado inmunizante de mtx-C-BSA, y el suero policlonal se valoró a través de ensayos ELISA competitivos tanto en formato directo como indirecto que permitieron evaluar la afinidad de los anticuerpos policlonales hacia MTX con valores de IC50 del orden 3 nM. De esta manera, se comprobó la viabilidad de los bioconjugados proteicos del MTX preparados. No obstante, a las cargas hapténicas bajas de los bioconjugados preparados, se accedió satisfactoriamente a un lote de anticuerpos policlonales de conejo que exhibieron curvas de inhibición, con valores de IC50 cercanos a 3 nM permitiendo encontrar las condiciones óptimas para establecer un inmunoensayo c-ELISA en formato indirecto para la identificación del metotrexato en una matriz acuosa.